enzymologia - ćwiczenie 5 i 6, enzymologia, Enzymologia - sprawozdania
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/11/14
Sprawozdanie 4.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 5.
Oznaczanie N-końcowych reszt aminowych
białka metodą dansylowania
Ćwiczenie 5. Wstęp
Białka (peptydy) są zbudowane z aminokwasów połączonych szeregowo wiązaniami
peptydowymi. Kolejność aminokwasów wyznacza sekwencję peptydu. Tak utworzony
łańcuch jest polarny; ma wyróżniony C-koniec z grupą karboksylową oraz N-koniec
zawierający grupę aminową.
Poznawanie sekwencji białka można rozpocząć od oznaczenia aminokwasu na N-końcu.
Jedną z metodą jest dansylowanie. Substratem reakcji jest chlorek dansylu (DNS-Cl), który
reaguje m.in. z I i II rzędowymi aminami na N-końcu. Tak utworzone pochodne
sulfonamidowe mają silne właściwości fluoryzujące. Po dansylowaniu peptydu należy
go zhydrolizować. Dodatkowo należy niezależnie dansylować aminokwasy, które posłużą jako
wzorce odniesienia do identyfikacji aminokwasu na N-końcu.
Ćwiczenie 5. Cel
Dansylowanie peptydu P1 oraz dansylowanie aminokwasów: Arg, Gly, Pro.
Przygotowanie próbek do Ćwiczenia 6.
NH
O
H
2
N
O
O
H
OH
OH
OH
H
NH
2
(b)
NH
2
(a)
(c)
Rysunek 1. – wzory aminokwasów: (a) arginina (Arg), (b) glicyna (Gly), (c) prolina (Pro).
Ćwiczenie 5. Wykonanie
Przygotowania do dansylowania aminokwasów i badanego peptydu P1 prowadzono równolegle.
Do trzech szklanych ampułek odmierzono po 100 μl aminokwasów (Arg, Gly, Pro). Odparowano
zawartość ampułek pod próżnią. Dodano po 0,5 ml 0,1 M NaHCO
3
oraz po 0,25 ml roztworu
chlorku dansylu (5 mg/ml) w acetonie. Inkubowano przez 30 min w 37°C. Reakcję przerwano
dodając po 25 μl 85% kwasu mrówkowego. Ampułki zamknięto parafilmem.
Do dwóch ampułek odmierzono po 10 μl peptydu P1. Odparowano zawartość ampułek
pod próżnią. Dodano po 20 μl 0,2 M NaHCO
3
. Odparowano zawartość ampułek pod próżnią.
Dodano po 20 μl wody dejonizowanej. Sprawdzono poziom pH. Dodano po 20 μl roztworu
chlorku dansylu (5 mg/ml) w acetonie. Inkubowano przez 60 min w 37°C. Odparowano zawartość
ampułek pod próżnią. Dodano po 100 μl stałowrzącego HCl. Zatopiono ampułki nad palnikiem.
Asystent techniczny poddawał próbkę chemicznej hydrolizie wiązań peptydowych w temperaturze
105°C przez 18 godzin.
Ćwiczenie 5. Wyniki
Trzy ampułki zamknięte parafilmem z DNS-aminokwasami.
Dwie zatopione ampułki z peptydem P1 przeznaczone do hydrolizy.
Ćwiczenie 5. Wnioski
Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 6. Wnioski.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/11/19
Sprawozdanie 4.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 6.
Identyfikacja dansylowanych
aminokwasów metodą cienkowarstwowej
chromatografii na płytkach poliamidowych
Mateusz Jędrzejewski
odróbka z grupą IV
Ćwiczenie 6. Wstęp
Chromatografia jest techniką służąca do badania składu mieszaniny związków chemicznych.
Pierwszy etap to rozdział roztworu na złożu. Drugi etap to identyfikacja składników.
W chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin layer chromatography) fazą rozdzielczą
(złożem) jest sztywna płytka. Można użyć płytek z żelem krzemionkowym – mniejsza
rozdzielczość. Natomiast płytki poliamidowe dają dobrą rozdzielność. Rozdział na płytce
następuje gdy eluent dyfunduje w górę płytki. Szybkość poszczególnych składników
rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między
związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy
czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony. Identyfikacja
składników na płytce jest możliwa poprzez porównanie ze wzorcami. Składniki na płytce
powinny być fluoryzujące lub barwne, jeżeli nie to trzeba je wybarwić. W szczególności
metoda nadaje się do identyfikacji DNS-aminokwasów.
Miarą rozdziału chromatograficznego jest współczynnik opóźnienia, czyli rozdziału
(ang. retardation factor). Definiowany jako iloraz drogi przebytej przez daną substancję (
)
do drogi przebytej przez czoło eluentu (
), zgodnie ze wzorem (1).
,
(1)
Ćwiczenie 6. Cel
Oznaczenie N-końcowego aminokwasu w peptydzie P1 chromatograficznie. W tym celu
prowadzono rozdzielanie dla DNS-aminokwasów oraz shydrolizowanej próbki P1 zwierającej
DNS-aminokwas N-końcowy. Wykorzystano dwa układu rozdzielające.
Układ 1: octan etylu, etanol, amoniak (20:5:1)
Układ 2: n-propanol; chloroform; 99,7% kwas octowy (80:20:5)
Ćwiczenie 6. Wykonanie
Przygotowano dwie płytki poliamidowe (o wymiarach 5 na 5 cm). Miejsce nakładania
preparatu zaznaczono ołówkiem po 1 cm od brzegów, na jednej symbolem „x” na drugiej „o”.
Do probówki eppendorfa odmierzono po 50 μl każdego z trzech DNS-aminokwasów i mieszano.
Do próbki peptydu dodano 10 μl pirydyny i mieszano. Nakładano kroplami w miejsce „x”
roztwór peptydu. Po każdej nałożonej kropli płytę suszono. Analogicznie nakładano w miejsce
„o” roztwór aminokwasów.
Do kuwety wlano układ 1. Płytki wstawiono do statywu. Statyw częściowo włożono
do kuwety (ponad poziom cieczy). Statyw poziomowano. Odczekano 15 min. Statyw zanurzono
całkowicie w kuwecie (do dna kuwety). Odczekano aż eluent przedyfunduje do góry płytek.
Statyw wyjęto. Płytki wyruszono. Kuwetę umyto.
Statyw odwrócono o 90° w zaznaczonym kierunku na statywie. Do kuwety wlano układ 2.
Płytki wstawiono do statywu. Statyw częściowo włożono do kuwety (ponad poziom cieczy).
Statyw poziomowano. Odczekano 15 min. Statyw zanurzono całkowicie w kuwecie (do dna
kuwety). Odczekano aż eluent przedyfunduje do góry płytek. Statyw wyjęto. Kuwetę umyto.
Płytki wyruszono. Oglądano płytki w świetle UV.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/11/19
Sprawozdanie 4.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
ŚR, 16:10-18:45, F-4/C3
Ćwiczenie 6.
Identyfikacja dansylowanych
aminokwasów metodą cienkowarstwowej
chromatografii na płytkach poliamidowych
Mateusz Jędrzejewski
odróbka z grupą IV
Ćwiczenie 6. Wyniki
Otrzymany rozdział na płytkach oglądano pod lampą UV przy 365 nm.
(a)
(b)
Pro
Arg
Gly*
Gly
DNS
DNS
(c)
(d)
Układ 1
Układ 1
gdzie: * identyfikowany N-końcowy aminokwas; wymienione aminokwasy są zdansylowane.
Rysunek 2. – rozdział chromatograficzny płytek w świetle UV (obraz przekonwertowano na odcienie szarości,
ciemne obszary to większa fluorescencja): (a) fluorescencja DNS-aminokwasów (wzorzec), (b) fluorescencja
hydrolizatu peptydu (badana próbka), (c) opisany schemat wzorca, (d) opisany schemat badanej próbki.
Obliczenia współczynników rozdziału DNS-aminokwasów
, Arg
układ 1
,
cm
cm
układ 2
,
cm
cm
0,11
, Arg
0,60
układ 1
,
cm
cm
układ 2
,
cm
cm
, Gly
0,32
, Gly
0,47
układ 1
,
cm
cm
układ 2
,
cm
cm
, Pro
0,41
, Pro
0,77
układ 1
,
cm
cm
układ 2
,
cm
, *
cm
0,44
Współczynniki rozdziału * są zbliżone do współczynników rozdziału DNS-glicyny.
0,33
, *
Ćwiczenie 6. Wnioski
pH roztworu z peptydem było równe 9 co pozwoliło na skuteczne oznaczenie N-końcowego
aminokwasu. Roztwory po dansylowaniu zmieniły kolor z żółtego na bezbarwny.
Badany peptyd P1 na N-końcu zawierał glicynę.
Załączniki
1.
Instrukcja „Ćwiczenie 5.” wraz z bieżącymi notatkami.
2.
Instrukcja „Ćwiczenie 6.” wraz z bieżącymi notatkami.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]