enzymologia - ćwiczenie 2, enzymologia, Enzymologia - sprawozdania
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 4
Data zajęć: 2008/10/24
Sprawozdanie 2.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 2.
Sporządzenie nasyconego roztworu
siarczanu amonu.
Ćwiczenie 2. Wstęp
Siarczan amonu
NH
SO
to bezbarwne ciało stałe; substancja krystaliczna i higroskopijna.
Masa molowa 132,14
[1]
g/mol; gęstość 1,77
[1]
g/cm
3
(20°C), rozpuszczalność w wodzie 760
[1]
g/l (20°C),
pH 5-6
[1]
(50 g/l H
2
O, 20°C). Rozpuszczalność znacznie zależy od temperatury. Sól hydrolizuje,
zgodnie z reakcją 1., a przez to pH jest lekko kwaśne (sól mocnego kwasu i słabej zasady).
NH
2H
O NH
OH H
O
(Reakcja 1.)
Rozpuszczalność białek zależy w szczególności od: temperatury, pH, siły jonowej roztworu oraz zdolności
białka do hydratacji. Wysalanie białek jest procesem wytrącania białka z roztworu. Polega na uszkodzeniu
otoczki hydratacyjnej, białko staje się mniej rozpuszczalne. Rozpuszczalność większości białek zmniejsza
się w roztworach stężonych soli (zmiana siły jonowej roztworu). Często stosowaną solą do wysalania
białek jest siarczan amonu. Białko najłatwiej wysolić w pH równym jego punktowi izoelektrycznemu
(wówczas rozpuszczalność białka jest najmniejsza). Jest to proces odwracalny. Rozpuszczalności różnych
białek są różne. Wysalanie stosuje się do frakcjonowania białek, wstępnego oczyszczania, a w szczególności
do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek. Sól można usunąć z roztworu stosując dializę.
Ćwiczenie 2. Cel
Przygotowanie 100 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu potrzebnego do Ćwiczenia 3.
Ćwiczenie 2. Wykonanie
Przygotowano zlewkę 300 ml. Podgrzewając i mieszając rozpuszczono 90 g siarczanu amonu
w 100 ml 1 mM EDTA. Pod wyciągiem miareczkowano roztwór 5% roztworem amoniaku do pH 7,5.
Ciepły roztwór przesączono przez lejek Büchnera, użyto pompki wodnej. Przesączony roztwór
przelano do zlewki 300 ml. Zlewkę podpisano i przykryto folią aluminiową.
Ćwiczenie 2. Wyniki
Używając wagi analitycznej odważono 90 g siarczanu amonu.
NH
SO
90 g
zlewki
130,6 g
ważona
NH
SO
zlewki
220,6 g
Używając cylindra miarowego zmierzono 100 ml 1 mM EDTA. Używając uniwersalnych papierków
wskaźnikowych określano pH roztworu (żółty pH 6,0; zielony pH 7,0; ciemnozielony pH 7,5).
Ćwiczenie 2. Wnioski
Otrzymano ok. 100 ml nasyconego roztwór siarczanu amonu o pH 7,5. Podczas ogrzewania
nieznaczna ilość roztworu mogła wyparować. Intensywnie mieszano, dzięki temu rozpuszczono cały
dodany siarczan amonu. Rozpuszczalność siarczanu amonu rośnie wraz z temperaturą. Przy sączeniu
roztwór ostygał. Niewielkie ilości nadmiaru siarczanu amonu wykrystalizowały na sączku.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 4
Data zajęć: 2008/10/24
Sprawozdanie 2.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.
W ramach dodatkowego zadania powtórzono Ćwiczenie 1. z dnia 2008/10/17.
Ćwiczenie 1. Wstęp
Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane
są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz
glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 2.)
2-
2-
CH
2
OPO
3
C
C
C
C
CH
2
OPO
3
CH
2
OPO
3
C
C
H
O
H
O
OH
H
O
aldolaza
C
C
CH
2
OPO
3
+
H
O
H
H
OH
H
OH
2-
OH
2-
fruktozo-1,6-disfosforan
fosfodihydroksyaceton
aldehyd
3-fosfoglicerynowy
Reakcja 2. – Reakcja katalizowana przez aldolazę
Stężenia enzymu
można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji
przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie
to współczynnik ekstynkcji, a
to długość
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.
· ·
(1)
Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)
w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności
U
definiuje się zgodnie ze wzorem (2).
U
µmol substratu
min
(2)
Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym
oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.
W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny
w stosunku 1:1.
Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).
(3)
Ćwiczenie 1. Cel
Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.
Porównanie otrzymanych wyników z Ćwiczeniem 1. z dnia 2008/10/17.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 4
Data zajęć: 2008/10/24
Sprawozdanie 2.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.
Ćwiczenie 1. Wykonanie
W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA).
Zmieszano z 60 μl stężonego roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). Odnośnik sporządzono
używając samego buforu. Zmierzono absorbancję
względem odnośnika przy 280 nm.
W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartym
w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 μl 30 mM fruktozodifosforanu. Odnośnik
sporządzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr względem odnośnika. Dodano 25 μl roztworu
aldolazy z części I, natomiast do odnośnika dodano taką samą objętość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM
EDTA). Zmierzono absorbancję
względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty. Część II powtórzono.
Ćwiczenie 1. Wyniki
Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych
pomiar 1° pomiar 2° średnia*
uwagi
µl
60
-
odczyt
ze spektrofotometru
0,1842
ald
mg/ml
ald
,%
·
0,2024
ald
µl
ald
25
odczyt z wykresu 1.
0,13
0,09
0,11
odczyt z wykresu 1.
0,32
0,30
0,31
Δ
Δ
0,19
0,21
0,20
ald
mg/ml
ald
ald
2,933 ∙ 10
–3
Δt
min
3
3
3
-
Akt
ald
U/ml
··∆
· 10
0,0244
Akt
ald
0,0232
0,0256
Akt
tot
U
Akt
tot
Akt
ald
·
0,0400
0,0442
0,0421
Akt
spec
ald
U/mg
Akt
ald
Akt
spec
7,91
8,73
8,32
* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.
gdzie: masa aldolazy:
ald
5 µg
długość drogi optycznej (szerokość kuwety):
1 cm
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm):
,%
0,91
ml
mg·cm
molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm):
2730
1
M·cm
objętość:
1,5 ml 200 µl 25 µl 1725 µl 1,725 ml
rozcieńczenie:
µl
69
µl
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 4 z 4
Data zajęć: 2008/10/24
Sprawozdanie 2.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.
Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy
wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2°
uwagi
ald
mg/ml
·
ald
ald
·
·
ald
10,3
Akt
ald
U/ml
·
· Akt
ald
Akt
ald
85,9
Akt
tot
*
U
Akt
tot
Akt
ald
·
85,9
ald
·
·
ald
Akt
spec
U/mg
Akt
ald
·
·Akt
ald
Akt
spec
Akt
spec
8,32
* objętość wyjściowego preparatu aldolazy
1 ml
.
gdzie:
rozcieńczenie:
µl µl
µl
51
Ćwiczenie 1. Wnioski
Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami
spektrofotometrycznymi. Stężenie aldolazy w roztworze wyjściowym wynosi 10,3 mg/ml.
Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie, z dobrym
przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,
im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita
(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia
enzymu i wynosi średnio 8,32 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych
od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,58).
Ćwiczenie 1. wykonano mniej dokładnie niż dnia 2008/10/17 (wtedy odchylenie standardowe
wyników wynosiło 0,15). Aktywność specyficzną wyznaczono wówczas na 7,58 U/mg.
Pomiary wykonywano korzystając z tego samego spektrofotometru.
Test hydrazynowy pozwolił na wyznaczenie aktywności aldolazy. Jest to szybka i prosta
metoda. Jej zastosowanie było możliwe, ponieważ w reakcji powstawał produkt H, który
posiadał maksimum absorbancji przy 240 nm. Inne substraty reakcji w roztworze praktycznie
nie absorbowały przy 240 nm.
Załączniki
1.
Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).
2.
Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi obliczeniami.
3.
Instrukcja „Ćwiczenie 2.” wraz z bieżącymi obliczeniami.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]