enzymologia - ćwiczenie 1, enzymologia, Enzymologia - sprawozdania
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/10/17
Sprawozdanie 1.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.
Wstęp
Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane
są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz
glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.)
2-
2-
CH
2
OPO
3
C
C
C
C
CH
2
OPO
3
CH
2
OPO
3
C
C
H
O
H
O
OH
H
O
aldolaza
C
C
CH
2
OPO
3
+
H
O
H
H
OH
H
OH
2-
OH
2-
fruktozo-1,6-disfosforan
fosfodihydroksyaceton
aldehyd
3-fosfoglicerynowy
Reakcja 1. – Reakcja katalizowana przez aldolazę
Stężenia enzymu
można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji
przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie
to współczynnik ekstynkcji, a
do długość
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.
· ·
(1)
Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)
w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności
U
definiuje się zgodnie ze wzorem (2).
U
µmol substratu
min
(2)
Test hydrozynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym
oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.
W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny
w stosunku 1:1.
Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).
(3)
Cel
Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.
Wykonanie {Trzeba dopisać treść instrukcji, sam załącznik to za mało}
Doświadczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji. Do wyznaczenia
stężenia aldolazy użyto po 3000 μl buforu oraz odmierzono 60 μl stężonego roztworu aldolazy.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/10/17
Sprawozdanie 1.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.
Wyniki
Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych
pomiar 1° pomiar 2° średnia*
uwagi
µl
60
-
odczyt
ze spektrofotometru
0,1954
ald
mg/ml
ald
,%
·
0,2147
µl
ald
ald
23
odczyt z wykresu 1.
0,09
0,08
0,085
odczyt z wykresu 1.
0,265
0,26
0,262
Δ
Δ
0,175
0,18
0,178
ald
mg/ml
ald
ald
2,866 ∙ 10
–3
Δt
min
3
3
3
-
Akt
ald
U/ml
··∆
· 10
0,0217
Akt
ald
0,0214
0,0220
Akt
tot
U
Akt
tot
Akt
ald
·
0,0369
0,0379
0,0374
ald
Akt
spec
U/mg
Akt
ald
Akt
spec
7,47
7,68
7,58
* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.
gdzie:
masa aldolazy:
ald
5 µg
długość drogi optycznej (szerokość kuwety):
1 cm
,%
0,91
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm):
ml
mg·cm
molowy współczynnik ekstynkcji dla hydronazonu GAP (przy 240 nm):
2730
1
M·cm
objętość:
1,5 ml 200 µl 23 µl 1723 µl 1,723 ml
rozcieńczenie:
µl
74,9
µl
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/10/17
Sprawozdanie 1.
Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś
Ćwiczenie 1.
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.
Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy
wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2°
uwagi
ald
mg/ml
·
ald
ald
·
·
ald
10,9
Akt
ald
U/ml
·
· Akt
ald
Akt
ald
82,9
Akt
tot
*
U
Akt
tot
Akt
ald
·
82,9
ald
·
·
ald
Akt
spec
U/mg
Akt
ald
·
·Akt
ald
Akt
spec
Akt
spec
7,58
* objętość wyjściowego preparatu aldolazy
1 ml
.
gdzie:
rozcieńczenie:
µl µl
µl
51
Wnioski
Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami
spektrofotometrycznymi. Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie,
z dobrym przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,
im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita
(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia
enzymu i wynosi średnio 7,58 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych
od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,15).
{Można było dodać coś o samym teście enzymatycznym.}
Załączniki
1.
Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).
2.
Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi notatkami.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]