enzymologia, UCZELNIA HiT, II ROK, Enzymologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
4. Wprowadzenie do enzymologii
4. Wprowadzenie do enzymologii
4.1. Koncepcja biokatalizy
W ˝ywym organizmie zachodzà tysiàce ró˝nych reakcji chemicznych. Wi´kszoÊç z nich wy-
maga dostarczenia z zewnàtrz energii, w przeciwnym razie nawet si´ nie rozpocznà (mówimy,
˝e nie zostanà zainicjowane). W temperaturach, w których mo˝e funkcjonowaç ˝ywy orga-
nizm, tempo tych reakcji jest tak ma∏e, ˝e a˝ niezauwa˝alne. Wynika to z tego, ˝e energia we-
wn´trzna uk∏adu, który ma reagowaç, jest zbyt niska. Dlatego atomy i (lub) czàsteczki
zderzajà si´ ze sobà zbyt rzadko i niezbyt mocno. Nie wystarcza to do pokonania bariery
pro-
gu energetycznego reakcji
. Mo˝na powiedzieç (w ogromnym uproszczeniu), ˝e substraty sà
zbyt leniwe i powolne, aby reagowaç.
Tak wi´c, aby znaczàco przyspieszyç pr´dkoÊç reakcji, mo˝na:
1. Dostarczyç energii do uk∏adu przez
podniesienie
temperatury
– niewàtpliwie osiàgniemy sukces, bo-
wiem szybkoÊç reakcji zwi´kszy si´ w miar´ wzrostu
temperatury. B´dzie to jednak pyrrusowe zwyci´-
stwo – coÊ w rodzaju: „operacja si´ uda∏a, tylko pa-
cjent zmar∏”. Wynika to z tego, ˝e bia∏ka ustrojowe
denaturujà ju˝ w temperaturze ok. 45°C (por.
ROZDZ. 2.2). Tymczasem organizm zginie, zanim
osiàgnie po˝àdane tempo metabolizmu (por. te˝ ryc. 16). Nale˝y tutaj dodaç, ˝e energia
cieplna zaliczana jest do form nisko u˝ytecznych biologicznie – trudno jà magazynowaç,
przerabiaç i przesy∏aç. Ciep∏o jest wi´c z∏em koniecznym, a jego dostarczanie musi byç roz-
sàdnie ograniczane (por. PODR. KL. II).
2.
Dostarczyç innej formy energii
, na przyk∏ad Êwietl-
nej, o wysokiej u˝ytecznoÊci biologicznej. Niestety,
iloÊç Êwiat∏a, jaka by∏aby tu niezb´dna, to luksus
rzadko spotykany na naszej planecie (pomijam ju˝
problem, co np. robiç nocà?).
3. Zrezygnowaç z
„pomys∏u” dostarczania du˝ych por-
cji energii i zadowoliç si´ ma∏ymi
. W ten sposób po-
zostaniemy w zakresie temperatur dozwolonych
– tolerowalnych przez organizm. Rozwiàzania wymaga jedynie drobiazg – mniej wi´cej mi-
lion razy za wolne tempo reakcji biochemicznych w stosunku do potrzeb. Za∏amywaç ràk
nie trzeba, nale˝y obejÊç to ograniczenie przez zastosowanie
enzymów
(dawniej fermen-
tów). Nazwa tych zwiàzków pochodzi z greckiego
enzyme
, co oznacza czynnik obecny
w dro˝d˝ach, i zosta∏a wprowadzona przez Niemca Kuhnego, który bada∏ fermentacj´ al-
koholowà.
Enzymy sà
katalizatorami
, gdy˝ majà w∏aÊciwoÊç
zwi´kszania szybkoÊci reakcji chemicz-
nych
, same jednak
nie ulegajà przemianom
. Mówimy wi´c, ˝e enzymy nie zu˝ywajà si´
w przeprowadzanych przez siebie reakcjach (por. jednak ni˝ej).
31
MOLEKULARNE POD¸O˚E BIOLOGII
Ryc. 16.
Ogólne zasady energetyczne reakcji niekatali-
zowanych i katalizowanych ustroju
(Ea
1
– energia aktywacji dla reakcji niekatali-
zowanej, Ea
2
– energia aktywacji dla reakcji
przyspieszanej przez enzym,
Uwaga:
Oprócz enzymów do biokatalizatorów zalicza si´ (skàdinàd nies∏usznie) hormony
i witaminy! W tej ksià˝ce poj´cie biokatalizatora b´dzie si´ jednak odnosi∏o tylko do
enzymów (w przeciwnym razie zostanie to wyraênie zaznaczone).
4.2. Budowa i dzia∏anie enzymów
WSZYSTKIE POZNANE DOTYCHCZAS ENZYMY SÑ BIA¸KAMI
Od czasu odkrycia i wyodr´bnienia w postaci krystalicznej pierwszego enzymu –
ureazy
(dokona∏ tego Sumner w 1926 r.) wyizolowano, oczyszczono i zanalizowano setki ró˝nych bio-
katalizatorów. Zdecydowana wi´kszoÊç z nich nale˝y do
bia∏ek z∏o˝onych
. Jedynie cz´Êç hy-
drolaz i nieliczne izomerazy sà bia∏kami prostymi (por. ni˝ej). W zasadzie wi´c ca∏a
czàsteczka biokatalizatora, tak zwany
holoenzym
(gr.
holo
oznacza ca∏y), sk∏ada si´ z:
a) cz´Êci bia∏kowej –
apoenzymu
;
b) cz´Êci niebia∏kowej –
grupy prostetycznej
, przy∏àczonej do apoenzymu. JeÊli cz´Êç
niebia∏kowa po∏àczona jest nietrwale z apoenzymem, wówczas mówi si´ o
koenzy-
mie
. W celu unikni´cia zamieszania proponuj´ u˝ywaç nazwy
kofaktor
dla cz´Êci nie-
bia∏kowej (jest to jednak zabieg nieformalny!).
Nale˝y zadaç sobie trud znalezienia odpowiedzi na pytanie: dlaczego do przeprowadze-
nia reakcji enzym potrzebuje tylko niewielkiej porcji energii?
Ca∏e rozwiàzanie polega na tworzeniu przez enzym (E) przejÊciowego po∏àczenia z sub-
stratem (S) albo z substratami (zale˝y to od enzymu i rodzaju reakcji – znajdê kilka przyk∏a-
dów!). To po∏àczenie nazywa si´
kompleksem enzym-substrat
(E-S). Ogólne równanie
reakcji katalizowanej przez enzym mo˝na zapisaç nast´pujàco:
W momencie wytworzenia kompleksu E-S w samym substracie dochodzi do przesuwania
okreÊlonych elektronów. Skutkiem jest powstawanie nowych wiàzaƒ lub rozrywanie ju˝ ist-
niejàcych. ÂciÊle mówiàc, obecnoÊç enzymu daje nast´pujàce korzyÊci:
1. Zwi´ksza si´
prawdopodobieƒstwo zderzeƒ
pomi´dzy reagujàcymi czàsteczkami. To tak,
jak gdyby ktoÊ zbli˝y∏ do siebie zagubione osoby – bez tej interwencji szansa na spotkanie
by∏aby niewielka.
32
G – zmiana
energii swobodnej reakcji). Zwróç uwag´ na
poziom energetyczny substratu i produktu.
∆
4. Wprowadzenie do enzymologii
2. Substraty zostajà prawid∏owo
zorientowane
w przestrzeni trójwymiarowej – czàsteczki
w roztworze bez enzymu zderzajà si´ bez∏adnie, najcz´Êciej nie tymi „cz´Êciami” co trzeba.
Biokatalizator spe∏nia wi´c funkcj´ kogoÊ, kto ustawia je wzgl´dem siebie tak, ˝e reagujà-
ce wiàzania znajdà si´ w bezpoÊrednim sàsiedztwie.
3. Dochodzi do
napr´˝ania wiàzaƒ
w substracie – w momencie wpasowywania substratu do
enzymu (tworzenia kompleksu E-S) nast´puje nadwer´˝anie wiàzaƒ w samym substracie.
Takie naruszone wiàzanie doÊç ∏atwo mo˝na teraz zmieniç (por. tak˝e ni˝ej).
Nie oznacza to jednak, ˝e enzym mo˝e zrobiç z reakcjà, co chce. Przede wszystkim jego
obecnoÊç
nie przesuwa stanu równowagi
katalizowanej przemiany. Wyobraê sobie odwracal-
nà reakcj´, w której równowaga ustala si´ na nast´pujàcym poziomie: substratu jest 200 razy
wi´cej ni˝ produktu. I nie jest wa˝ne, czy enzym b´dzie obecny czy nie – wartoÊç ta nie ule-
gnie zmianie. KorzyÊci zastosowania biokatalizatora sà nast´pujàce:
a) znacznie szybsze
osiàgni´cie stanu równowagi
(w przybli˝eniu przyspieszenie reakcji –
por. ni˝ej);
b) zmniejszenie energii aktywacji – tej minimalnej porcji energii, która podniesie poziom
energetyczny substratu do progu umo˝liwiajàcego zainicjowanie i przeprowadzenie da-
nej reakcji (por. ryc. 16).
Istnieje tak˝e inne powa˝ne ograniczenie pracy biokatalizatorów. Jest nim problem
energetyczny – w warunkach ustrojowych enzymy mogà
przyspieszaç jedynie reakcje egzo-
ergiczne
(por. ryc. 16). Czy˝byÊmy mieli wi´c „biochemiczny pat” w wypadku reakcji endo-
ergicznych? Rozwiàzanie jest proste: trzeba w sensownym zakresie podnieÊç poziom
energetyczny substratu, ˝eby reakcja sta∏a si´ egzoergiczna. Jak „do∏adowaç” taki uk∏ad, wy-
jaÊni´ dok∏adniej w ROZDZ. 4.4. Tutaj musisz zadowoliç si´ stwierdzeniem, ˝e istniejà wy-
specjalizowane czàsteczki powstajàce w reakcjach silnie egzoergicznych, gromadzàce
w sobie energi´, którà potem mogà oddawaç na wspomniane do∏adowanie.
KA˚DY ENZYM MA CENTRUM AKTYWNE
Du˝a skàdinàd czàsteczka enzymu ma zawsze na swojej powierzchni ma∏e zag∏´bienie,
które nazwano
centrum aktywnym
(miejscem aktywnym; por. ryc. 17 i 18). Miejsce aktywne
jest przestrzennym wg∏´bieniem w kszta∏cie rowka lub do∏ka, zawierajàcym odpowiednie
aminokwasy. Ten „do∏ek” jest najwa˝niejszà cz´-
Êcià ca∏ej makroczàsteczki biokatalizatora.
Wchodzi tu bowiem substrat, tutaj tak˝e przy∏à-
cza si´ grupa prostetyczna (o ile wyst´puje).
¸aƒcuchy boczne (R) aminokwasów umo˝liwia-
jà rozpoznawanie, wpasowywanie i reagowanie
konkretnego substratu.
Ryc. 17. Prosty model budowy enzymu
Dlatego cz´sto nazywa si´ je
grupami katalitycznymi enzymu
. Liczba tych grup jest ró˝-
na (zale˝y od rodzaju enzymu), ale zawsze jest ich kilka do kilkunastu. Rodzaj i rozmieszcze-
nie przestrzenne aminokwasów w centrum aktywnym decyduje o w∏aÊciwoÊciach
konkretnego enzymu (por. ni˝ej klasyfikacja enzymów). Zwykle miejsca te zawierajà zarów-
no kilka niepolarnych, jak i polarnych reszt aminokwasowych, co zapewnia odpowiednie mi-
kroÊrodowisko.
33
MOLEKULARNE POD¸O˚E BIOLOGII
ENZYMY SÑ SPECYFICZNE WZGL¢DEM SUBSTRATÓW
Budowanie bia∏kowego biokatalizatora kosztuje du˝o energii i materii, a jego trwa∏oÊç
jest ograniczona (por. ni˝ej). Dlatego nale˝y wykorzystaç do maksimum jego mo˝liwoÊci.
Przede wszystkim za∏ó˝my, ˝e komórka musi oszcz´dzaç energi´ i surowce. Oznacza to
mi´dzy innymi, ˝e nie staç jej na przeprowadzanie niepotrzebnych reakcji. Rozwiàzaniem jest
„specjalizacja” enzymów, która prowadzi do tego, ˝e katalizowane sà tylko reakcje po˝àdane.
Innà korzyÊcià jest wysoka sprawnoÊç takich wàskich specjalistów. W porównaniu z kataliza-
torami nieorganicznymi osiàgane pr´dkoÊci sà o kilka rz´dów wielkoÊci wi´ksze. Wymaga to
od enzymów zdolnoÊci do bardzo dok∏adnego rozpoznawania substratów, czyli
specyficzno-
Êci substratowej
.
Zasadniczo dany rodzaj enzymu przeprowadza tylko jeden rodzaj reakcji. Jest to pewne
rozwini´cie znanej Ci zasady:
jeden enzym – jedna reakcja
. Nie oznacza to wcale, ˝e enzym
przeprowadza jednà reakcj´ i ulega zniszczeniu. Czàsteczka biokatalizatora nie zu˝ywa si´
bowiem w pojedynczej przemianie – mo˝e przeprowadziç miliony takich operacji (mo˝na to
z grubsza porównaç do popularnego magnetowidu, który odtwarza bezawaryjnie wiele kaset).
Dlatego czàsteczka E widoczna po prawej stronie równania ogólnego (por. ryc.18) mo˝e po-
nownie przeprowadziç t´ reakcj´ z kolejnà czàsteczkà substratu. OczywiÊcie ˝ywotnoÊç ka˝-
dej struktury ma swoje granice – dlatego po jakimÊ czasie czàsteczki enzymu ulegajà
zestarzeniu (zu˝yciu) i ich liczba b´dzie musia∏a byç uzupe∏niona (z magnetowidem b´dzie
podobnie).
Enzymy ró˝nià si´ od siebie specyficznoÊcià, co jest zjawiskiem po˝àdanym, ale tak˝e nie-
bezpiecznym (por. ni˝ej inhibicja). Dla przyk∏adu
α
-amylazy naszego przewodu pokarmowe-
-glikozydowego i nie ma tu wi´kszego znaczenia, czy
substratem jest skrobia, glikogen czy dekstryna.
Uwaga:
Nie oznacza to jeszcze, ˝e amylazy dzia∏ajà „na Êlepo” – por. CZ¢Âå: ANATOMIA I …,
ROZDZ. 5.
α
Ryc. 18. Model ilustrujàcy przestrzenne dopasowanie substratu i enzymu wed∏ug modelu zamka
i klucza
Podobnie lipaza trzustkowa rozk∏ada wiàzania estrowe w ró˝nych t∏uszczach. Inne enzy-
my wykazujà znacznie wi´kszà dok∏adnoÊç w rozpoznawaniu substratu, na przyk∏ad anhydra-
za w´glanowa katalizuje tylko reakcje pomi´dzy dwutlenkiem w´gla i wodà. Inny
34
go rozk∏adajà wiàzania typu
4. Wprowadzenie do enzymologii
biokatalizator – polimeraza DNA I (przeprowadzajàca reakcje kopiowania DNA) w∏àcza do
syntetyzowanej nici nowe nukleotydy z dok∏adnoÊcià jednego b∏´du na 10 000 000 przepro-
wadzonych operacji.
SpecyficznoÊç enzymów dobrze oddaje
model zamka
i klucza,
sformu∏owana przez pana Fishera ju˝ w 1890 r.
Mówi ona, ˝e substrat pasuje do centrum aktywnego
enzymu tak jak klucz do zamka (por. ryc. 18).
Po prostu – odpowiednie ukszta∏towanie przestrzenne substratu znajduje odbicie w kon-
formacji miejsca aktywnego enzymu. Pozwala to na wejÊcie grup katalitycznych enzymu
w nietrwa∏e po∏àczenia z substratem i przeprowadzenie reakcji. Model Fishera jest prosty
i przekonywajàcy, nie wyjaÊnia jednak wszystkich aspektów katalizy enzymatycznej w ˝ywych
uk∏adach. Modelowanie matematyczne udowodni∏o bowiem, ˝e samo dopasowanie S do
E daje tylko dwie pierwsze z wymienionych wczeÊniej korzyÊci (przypomnij je sobie!). Nie po-
zwoli∏yby one na tak znaczne obni˝enie energii aktywacji. WyjaÊnienie tego problemu przed-
stawi∏ pan Koshland w swojej
teorii indukcyjnego dopasowania
(wymuszonego
dopasowania). W tym uj´ciu substrat niezbyt dok∏adnie pasuje przestrzennie do centrum ak-
tywnego. Inaczej mówiàc, konformacja obu sk∏adowych kompleksu E-S nie jest identyczna.
Otó˝ wchodzàc w s∏abe oddzia∏ywania z enzymem, S jest przez niego „wciàgany” do zag∏´bie-
nia centrum. W czasie dopasowywania nast´puje pewne odkszta∏cenie centrum i substratu.
Mo˝na wi´c oczekiwaç niewielkiego napr´˝enia (mniej wi´cej naderwania) wiàzaƒ w obu
komponentach. W tej sytuacji ju˝ niewielka porcja energii aktywacji wystarcza do pokonania
progu energetycznego reakcji. To, ˝e dochodzi do zmiany wiàzaƒ tylko w substracie, t∏umaczy
si´ czasem wielkoÊcià czàsteczki enzymu – przewaga masy daje mu wi´kszà stabilnoÊç i mniej-
szà podatnoÊç na odkszta∏cenia. Mamy wi´c tutaj wszystkie trzy przedstawione korzyÊci.
Czasem dla obrazowego wyjaÊnienia teorii Koshlanda mówi si´, ˝e substrat pasuje do
miejsca aktywnego jak r´ka do r´kawiczki (przemyÊl to dok∏adnie).
KINETYK¢ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ OBRAZUJE MODEL MICHAELIS-MENTEN
Ju˝ w 1913 roku panie Michaelis i Menten przedstawili bardzo prosty model charaktery-
zujàcy dynamik´ przebiegu katalizowanych reakcji. Za∏o˝eniem by∏o oczywiÊcie, ˝e zawsze
tworzy si´ kompleks E-S jako poÊredni etap ca∏ego procesu. W swojej podstawowej wersji
tzw.
równanie Michaelis-Menten
przyjmuje nast´pujàcà postaç (po uproszczeniu!):
gdzie V – pr´dkoÊç katalizowanej reakcji, V
max
– pr´dkoÊç maksymalna jakà mo˝na by∏o-
by teoretycznie osiàgnàç w warunkach optymalnych, [S] – st´˝enie substratu, K
M
– sta∏a Mi-
chaelis. Ta ostatnia jest równa takiej wartoÊci st´˝enia substratu, przy którym pr´dkoÊç reakcji
jest równa po∏owie pr´dkoÊci maksymalnej (por. ni˝ej).
Nie wdajàc si´ w zawi∏e wyjaÊnienia, spójrzmy na to równanie kraƒcowo:
1. JeÊli st´˝enie substratu jest bardzo du˝e, to wówczas mo˝emy w u∏amku pominàç K
M
(sta-
∏a ta ma niewielkà wartoÊç rz´du od 10
–1
do 10
–7
mola/litr). Równanie uproÊci si´ i przyjmie
praktycznà postaç:
35
[ Pobierz całość w formacie PDF ]