enzymologia 2011, Studia, Biochemia, Ćwiczenia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Badanie własności kinetycznych inwertazy (3.2.1.26;
fruktohydrolazy
b
-D-fruktofuranozydów)
1. Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej ( wyznaczanie stałej
Michaelisa )
zależności prostolinijnej np. wykres Lineweavera -
Burka (patrz dalej).
Wyznaczenie wartości K
m
tÄ… metodÄ… polega na :
- wykreśleniu krzywych kinetycznych
przyrostu stężenia produktu reakcji enzymatycznej
w czasie inkubacji dla kilku różnych stężeń
substratu
- graficznym znalezieniu szybkości
poczÄ…tkowych
- sporządzeniu wykresu zależności między
odwrotnością szybkości początkowej a
odwrotnością stężenia substratu i odczytaniu
wartości K
M
i V
max
w punktach charakterystycznych
wykresu
Zasada : Stężenie substratu jest jednym z
najważniejszych czynników określających szybkość
reakcji enzymatycznej. Stała Michaelisa K
m
jest
miarÄ… powinowactwa enzymu do substratu (
zależność jest odwrotnie proporcjonalna - im
większa wartość K
m
tym mniejsze powinowactwo
enzymu do substratu) i odpowiada takiemu jego
stężeniu, przy którym szybkość reakcji
enzymatycznej odpowiada połowie szybkości
maksymalnej. Wyznaczenie wartości K
m
z wykresu
Michaelisa - Menten jest obciążone poważnym
błędem, dlatego w praktyce stosuje się inne
graficzne metody, pozwalajÄ…ce na uzyskanie
Kinetyka działania inwertazy w obecności inhibitora kompetycyjnego
Zasada : Działanie inhibitora współzawodniczącego
można wykazać, oznaczając szybkość początkową
reakcji przy różnych stężeniach substratu i stałym
stężeniu inhibitora. Dla tego typu hamowania
równanie Lineweavera - Burka przyjmuje postać :
Równanie to można przedstawić graficznie
V
1
V
max
b
a
1
[S]
1
1
-
-
1
V
1
K
[I]
1
1
K
K
1
+
[I]
K
m
m
m
K
=
+
+
m
i
V
K
[S]
V
max
i
max
Graficzne przedstawienie równania Lineweavera -
Burka dla hamowania kompetycyjnego
gdzie : V - szybkość reakcji enzymatycznej
V
max
- szybkość maksymalna
K
m
- stała Michaelisa
K
i
- stała inhibicji
[I] - stężenie inhibitora
[S] - stężenie substratu
Stała hamowania, która odpowiada stężeniu
inhibitora, wywołującemu 50% zmniejszeia
szybkości reakcji enzymatycznej, może być
wyliczona na podstawie wyżej przedstawionego
równania i wykresu. Z wykresu wyznacza się
natomiast wartości K
m
i V
max
oraz wartości
nachylenia prostych ( tg
a
i tg
b
), co odpowiada
wyrażeniom :
4.1
Podstawiając dane oraz molowe stężenia inhibitora
do pierwszego wzoru (na tg
K
V
[I]
K
m
a
), można wyliczyć K
i
.
tg
=
1
+
a
max
i
K
V
m
tg
=
b
max
Kinetyka działania inwertazy w obecności inhibitora niekompetycyjnego
Inhibitory niekompetycyjne hamują szybkość
reakcji enzymatycznej przez działanie na wolny
enzym lub na kompleks ES. W przeciwieństwie do
inhibitorów kompetycyjnych hamowanie
niekompetycyjne nie zależy od stężenia substratu, a
tylko od stężenia inhibitora i wartości K
i
,
charakteryzujÄ…cej powinowactwo inhibitora do
enzymu. Nie występuje tu bezpośrednia
konkurencja między substratem i inhibitorem. Mogą
one zupełnie niezależnie reagować z cząsteczką
enzymu według reakcji :
W metodzie Lineweavera - Burka aktywność
enzymu oznacza się przy stałym stężeniu inhibitora
i różnych stężeniach substratu. Na wykresie
przedstawia się zależność 1/V od 1/S.
V
1
[I]
1
+
K
V
1
max
i
V
b
max
a
[S]
E + S
«
ES
®
E + P
-
1
K
E + S + I
«
IES
m
Graficzne przedstawienie równania Lineweavera -
Burka dla hamowania niekompetycyjnego
gdzie :IES - kompleks inhibitor - enzym - substrat
W przypadku hamowania niewspółzawodniczącego
inhibitor może nie wywierać wpływu na wartość
K
m
, lecz będzie obniżał V
max
. KinetykÄ™
hamowania niekompetycyjnego można badać
metodÄ… Dixona lub Lineweavera - Burka.
Trzeba pamiętać, że w wielu przypadkach reakcji
enzymatycznych występuje mieszany typ
hamowania, to znaczy, że w obecności inhibitora
obserwuje siÄ™ zmiany K
m
i V
max
.
Nachylenie prostej w obecności inhibitora jest
opisywane równaniem :
K
[I]
m
tg
a
=
1
+
V
K
max
i
natomiast nachylenie prostej bez inhibitora
odpowiada równaniu :
Zasada : W metodzie Dixona oznacza siÄ™
aktywność enzymu przy stałym stężeniu substratu,
ale przy różnych stężeniach inhibitora. Na wykresie
przedstawia się zależność 1/V od [I]. Analogiczne
oznaczenie wykonuje się dla dwóch stężeń enzymu
( S
1
, S
2
). Punkt przecięcia prostych daje wartość -
K
i
.
K
m
tg
b
=
V
max
Pełne równanie Lineweavera - Burka dla
hamowania niewspółzawodniczącego przyjmuje
postać :
S
V
1
S
2
1
[I]
1
V
K
V
1
[S]
m
=
1
+
+
V
V
max
max
max
[I]
-K
i
Wykres zależności odwrotności szybkości reakcji
enzymatycznej od stężenia inhibitora
niekompetycyjnego ( metoda Dixona )
4.2
 Przeprowadzenie doświadczeń:
A. Przygotować
odczynnik miedziowy
do met.
Somogyi-Nelsona: zmieszać 25 ml roztworu
węglanu/winianu z 1 ml r-ru CuSO
4
.
B. Przygotować po 1 ml r-ru sacharozy (substratu) o
rozcieńczeniach:
125; 62.5; 31,25; 15,625; 0
mM
C. Dla każdego ze stężeń substratu przeprowadzić
doświadczenie wg. poniższego opisu.
1. W 5 probówkach umieścić po 200
przeprowadzić identyczne pomiary dodając do
mieszaniny reakcyjnej zamiast 500
m
l buforu 500
m
l
13.2 mM roztworu AgNO
3
.
Wykonanie krzywej wzorcowej do oznaczania
cukrów redukujących met. Somogyi-Nelsona:
Przygotować po 200
l roztworów glukozy o
stężeniach: 2.4; 1.2; 0.6; 0.3; 0.15; 0 mM. Z
roztworami tymi postępować jak z próbkami
pobieranymi z mieszaniny reakcyjnej w
doświadczeniu opisanym wyżej.
Wykreślić zależność Abs
520
/c
glukozy
.
Odczynniki: Roztwory do oznaczania glukozy met.
Somogyi-Nelsona, roztwór wzorcowy glukozy (4.8
mM = 86.4 mg/100ml), 250 mM (8.55 g/100 ml)
roztwór sacharozy (nie zawierającej cukrów
redukujących), 2M (18,4 g/100 ml) roztwór
glicerolu, 13.2 mM (224 mg/100 ml) roztwór
AgNO
3
, preparat inwertazy rozcieńczony buforem
(stężenie zależne od aktywności enzymu), 50 mM
(wzgl. octanu sodu) bufor octanowy, pH 4.7;
wszystkie roztwory w tym buforze.
Uwaga!
Wszystkie roztwory przygotowywać i
przechowywać w naczyniach szklanych!
m
m
l odcz.
miedziowego.
2. W probówce reakcyjnej (krótkiej) umieścić 1 ml
r-ru substratu o pożądanym stężeniu i 500
m
l buforu
octanowego.
3. Włączając pomiar czasu dodać 1 ml roboczego
roztworu inwertazy, tak by cała zawartość probówki
uległa silnemu wymieszaniu. Natychmiast pobrać
200
l r-ru
miedziowego. Co 2 min przez 8 min pobierać z
mieszaniny próbki i postępować z nimi
analogicznie.
4. Serię probówek umieścić we wrzącej łaźni
wodnej na co najmniej 15 min, następnie ostudzić,
dodać po 200
m
l i dodać do przygotowanych 200
m
l odczynnika arsenowo-
molibdenowego i silnie wymieszać. Po ok. 1min
dodać 5 ml wody.
5. Mierzyć absorbancję wzgl. wody przy
m
=520 nm.
W celu zbadania kinetyki działania inwertazy w
obecności inhibitora kompetycyjnego
przeprowadzić identyczne pomiary dodając do
mieszaniny reakcyjnej zamiast 500
l
m
l buforu 500
m
l
2M roztworu glicerolu.
W celu zbadania kinetyki działania inwertazy w
obecności inhibitora niekompetycyjnego
Badanie specyficzności substratowej enzymów: inwertaza drożdży (3.2.1.26;
fruktohydrolaza
b
-D-fruktofuranozydów) i amylaza śliny (
a
- amylaza, 3.2.1.1;
glukanohydrolaza 1,4-
a
-D-glukanów).
Zasada: Obydwa badane enzymy powodujÄ…
hydrolizę wiązań glikozydowych określonego typu -
inwertaza działa na wiązanie 1-2-glikozydowe, zaś
amylaza na wiÄ…zanie 1-4-glikozydowe. Inwertaza
powoduje więc rozkład sacharozy a nie działa na
skrobię, natomiast amylaza wykazuje działanie
rozcieńczonej 10-krotnie wodą destylowaną, do
drugiej pary - po 200 ml roztworu inwertazy z
drożdży. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w
temperaturze 37
o
C, następnie wykonać z
wszystkimi próbkami reakcję Fehlinga.
Odczynniki: 1% roztwory sacharozy i skrobi, preparat inwertazy
z drożdzy, odczynnik Fehlinga 1 i 2.
Sprzęt: termostat lub łaźnia wodna o temperaturze 37
o
C, pipety
automatyczne na 200-1000 ml, wrząca łaźnia wodna.
hydrolityczne w stosunku do skrobi a nie rozkłada
sacharozy. Hydroliza obydwu cukrowców prowadzi
do powstania mono- lub disacharydów o
własnościach redukujących, natomiast sacharydy
wyjściowe są nieredukujące, co pozwala na łatwe
stwierdzenie zachodzenia reakcji.
Wykonanie: Przygotować 2 probówki zawierające 1
ml 1% roztworu skrobi i 2 probówki z 1 ml 1%
roztworu sacharozy. Do jednej pary probówek z
roztworem skrobi i sacharozy dodać po 200
m
l śliny
4.3
[ Pobierz całość w formacie PDF ]